Нобелевская премия по химии за 2003 год присуждена двум американским ученым - Р. Мак-Киннону и П. Эгру - за фундаментальные открытия, касающиеся переноса ионов и молекул воды через клеточную мембрану.
Первый из них расшифровал структурную и физическую основы функционирования ионных каналов, а второй - открыл и охарактеризовал канальный белок, служащий для проникновения молекул воды сквозь клеточную мембрану.
Родерик Мак-Киннон (Roderick MacKinnon), родившийся в 1956 г., вырос в Берлингтоне, пригороде Бостона (шт. Массачусетс). Окончил Университет Брендиса в Бостоне, в 1982 г. стал доктором медицины в бостонской Медицинской школе Тафтса. С 1996 г. - профессор молекулярной нейробиологии и биофизики в Рокфеллеровском университете (Нью-Йорк).
Р.Мак-Киннон и П.Эгр
От структуры любого соединения зависят, как известно, его свойства, а в живом организме и функции. Именно структурные исследования и послужили основой для понимания работы ионных каналов в клеточной мембране, образованных белковыми молекулами (или их комплексами), которые пронизывают ее насквозь. Работой канальных белков обеспечивается клеточный обмен веществами, в том числе неорганическими катионами (в основном K+, Na+ и Ca2+) и анионами (главным образом Cl-), причем почти для каждого вида ионов имеются свои собственные каналы. Благодаря передвижению ионов через мембрану на ней возникает разность потенциалов, генерируются электрические токи, без которых невозможна жизнь клетки, на передаче электрических сигналов основана работа мозга, важнейшего органа животных.
Еще в конце XVIII в. Л.Гальвани установил электрическое происхождение нервных импульсов. И только в начале 20-го столетия немецкий физиолог Дж.Бернштейн не доказал, а предположил, что разность электрических потенциалов между наружной и внутренней мембранными поверхностями нервной клетки обусловлена неодинаковым распределением ионов. Неудивительно, что работы по выяснению, как и благодаря чему это происходит, велись во многих лабораториях мира. За исследования, так или иначе связанные с проницаемостью мембран для заряженных частиц, уже присуждалась Нобелевская премия: в 1963 г. - Дж.Экклсу, А.Ходжкину и Э.Хаксли, в 1991 - Э.Нейеру и Б.Закману [1] (обе по физиологии и медицине), в 1997 - П.Бойеру, Дж.Уокеру и Й.-К.Скоу [2].
Мак-Киннон и его коллеги расшифровали структуры и механизм функционирования нескольких бактериальных белков, каждый из которых формирует канал, проводящий ионы калия в ответ на изменение мембранного потенциала. Для этого понадобилось использовать биохимические методы, мутагенез, клонирование белкового гена, экспрессию белка, получать моноклональные антитела, изучать влияние ингибиторов в электрофизиологических опытах. Из физических методов исследования применялась масс-спектрометрия, непосредственно структура белка была установлена рентгенокристаллографически и на ее основе построены стереомодели с помощью компьютера. Работа поистине гигантская и результаты весьма впечатляющие! Ведь не только определено положение каждого структурного элемента в общей конструкции канала, но и механизм, который обеспечивает избирательность катионной проводимости и чувствительность к изменению потенциала на мембране.
Любой ионный канал, или пора, имеет узкий селективный фильтр и ворота, причем образованы они разными структурными элементами белка. Ворота могут открываться и закрываться в ответ на изменение мембранного потенциала, концентрации иона, механическое воздействие, связывание с определенной сигнальной молекулой и т.д.
Катионные каналы (калиевые, натриевые и кальциевые), зависящие от потенциала на мембране и образующие большое семейство, построены по одному принципу. Самым подробным образом он представлен Мак-Кинноном на примере канального белка KvAP, выделенного из архебактерии Aeropyrum pernix. Его четыре одинаковые молекулы (субъединицы) окружают центральную проводящую ионы пору, стенки которой “облицованы” двумя гидрофобными спиральными сегментами - S5 и S6 - каждой субъединицы. Таких сегментов-спиралей, гибко соединенных между собой петлями, шесть. Вместе они составляют два разных функциональных участка - селективный фильтр (S5 и S6), определяющий ионную избирательность, и сенсор (S1-S4), реагирующий на изменение потенциала (рис.1). В этом структурном элементе особенно важны первые четыре остатка аргинина, несущие положительные заряды. За счет гибкости сочленения спиралей вся конструкция способна менять конформацию, чем обеспечивается закрытое или открытое состояние ворот и быстрый, избирательный перенос катионов.
Рис. 1. Стереомодель полного KvAP канала и одной субъединицы. Тетрамер изображен с внутренней стороны мембраны (1) и повернутым на 90° относительно горизонтальной оси (2); каждая субъединица показана своим цветом. Одна из них представлена отдельно (3) и дана также в виде схемы (4), чтобы были отчетливее видны топология спиральных сегментов (S1-S6), соединяющих петель (S3-петли, S4-S5-линкера), поры (Р) и фильтра. Здесь же приведены остатки аргинина (R117, 120, 123, 126, 133), четыре из которых находятся в “лопасти” сенсора. Буквами C и N обозначены карбоксильный и аминный концы полипептидной цепи.
Карбонильные атомы кислорода шести следующих друг за другом аминокислот (треонина, валина, глицина, тирозина и глицина), находящихся в узком селективном фильтре, направлены к его просвету, благодаря чему они координируют ионы калия. Боковые же цепи валина и тирозина - “смотрят” внутрь гидрофобной сердцевины, и тем стабилизируют основную цепь проводящей поры.
Сегмент S6 способен отклоняться от оси центральной поры за счет глицина, посредством которого сочленяется со спиралью S5. Соединенный с ней напрямую датчик потенциала во время работы канала оттягивает ее от оси поры, а следом отклоняется и спираль S6. Таким образом, они движутся вместе, как единое целое.
Положение сегментов фильтра и сенсорной части в KvAP было определено на основе его полной структуры, установленной рентгеноструктурным анализом с разрешением 3.2 A. Но если строение фильтра оказалось таким же, как в уже изученных Мак-Кинноном и его коллегами бактериальных канальных белках, то в сенсоре были выявлены весьма существенные отличия. Две его спирали (S1 и S2) располагались концентрическим слоем около фильтра (т.е. снаружи от S5), а другие (S3 и S4) - по наружному периметру центральной поры (см. рис.1). Кроме того, спираль S3 не представляла единой структуры, а состояла из двух фрагментов (S3a и S3b), соединенных петлей S3. И это оказалось очень важным. До Мак-Киннона сенсор традиционно описывали как комплект из четырех спиральных участков. Теперь же вырисовывалась иная картина: сегмент S3b и N-концевая часть спирали, которую прежде обозначали как S4, уложенные антипараллельно строго друг против друга, образовывали почти полностью гидрофобный элемент со структурой спираль-петля-спираль. Исключение составляли четыре гидрофильных остатка аргинина, которые встречаются во всех калиевых каналах, зависимых от потенциала. Исследователи назвали этот элемент (S3b-S4) единицей сенсорных “лопастей”. Находящиеся в нем высоко консервативные остатки положительно заряженного аргинина и несут заряд, обеспечивающий закрытое или открытое состояние ворот. Через петлю, разделяющую S3b и S4 спирали, весь элемент соединен с той частью белковой субъединицы, которая удерживает белок в липидном слое мембраны. Судя по структуре, “лопасти” датчика, расположенные сбоку от N-конца молекулы, ограничены петлей S3, а с карбоксильного конца соединены крутым витком (шарниром) по остатку глицина со спиралью S5. Такое сочленение позволяет “лопастям” свободно отклоняться относительно основного “тела” канала на внутренней стороне мембраны.
Найденное отличие в строении третьего сегмента по сравнению с традиционной моделью не было единственным. Сюрприз преподнесла четвертая спираль - она располагалась около внутренней поверхности мембраны (перпендикулярно оси поры). Но это противоречило всем электрофизиологическим данным: ингибиторы канала (токсины и серусодержащие реагенты) взаимодействуют с N-концевым фрагментом спирали S4 только с внешней стороны мембраны. Исследователи попытались понять, с чем связаны столь разительные отличия, и использовали весьма необычный подход: экспрессировали только часть встроенного в мембрану белка - его сенсорный элемент (фрагмент S1-S4) - отдельно от проводящей ионы поры. Выделив его в индивидуальном, не измененном процедурами, состоянии, они установили структуру сенсора (рис.2). Она была получена с разрешением 1.9 A!
Рис. 2. Стереомодель изолированного сенсора. Приведены некоторые особенно важные аминокислотные остатки: аргинина (R), пролина (P), аспарагиновой (D) и глутаминовой (E) кислот.
В изолированном сенсоре узнавались и шли в том же порядке все спирали, что и в сенсоре полной молекулы белка, петля S3 находилась на своем месте (между S3a и S3b), ничем не отличалась и “лопасть” сенсора. Судя по структуре, он не сжимается, будучи прикрепленным к поре. Подтвердилось и положение особенно важных первых четырех аргининов №№ 117, 120, 123, 126 (в кристаллах их боковые цепи обращены к растворителю).
Сравнение структур сенсора в составе полномерного белка и индивидуального, вычлененного из полной молекулы, привело к выводу, что “лопасть” представляет собой консервативную единицу калиевых каналов, регулируемых потенциалом, и что в связующем звене между спиралями S4 и S5 есть точки, в которых она может легко изгибаться. Где случаются изгибы и каков их угол, зависит от взаимного расположения “лопасти” и поры. Гидрофильный характер связующей спиральки показывает, что она очень подходит для пребывания в водной среде с внутриклеточной стороны мембраны.
Рис. 3. Модели, иллюстрирующие перенос положительных зарядов канальным калиевым белком в ответ на изменение потенциала на мембране. По традиционной версии, четвертая спираль каждой субъединицы несет заряды и движется внутри основного белкового тела по канальцу, а форма тетрамера остается неизменной. По мнению Мак-Киннона, заряды переносятся “лопастями”, которые движутся по наружной поверхности тетрамера, изменяя его форму.
Установленное по третичной структуре расположение “лопастей” противоречило их локализации, основанной на электрофизиологических экспериментах. Кроме того, в традиционных моделях постулировалось, что четвертая спираль любой субъединицы движется внутри собственной небольшой белковой полости, образованной другими частями молекулы, например спиралями 1-3 (рис.3). Мак-Киннон, исходя из своей структурной модели, предположил, что все происходит по-другому. “Лопасти”, находящиеся на внутренней стороне мембраны, перемещаются перпендикулярно к внешней без какой-либо выстланной белком полости и переносят таким образом заряды через электрическое поле (рис.3). Положение и передвижение “лопастей” было экспериментально подтверждено их связыванием с антителами, а также с помощью авидина, соединенного с биотином. Авидин, как гирька, подвешивается через ниточку биотина к “лопасти” и оттягивает ее (рис.4). Удалось даже измерить путь, который преодолевает каждая из них во время открывания ворот: он составляет примерно 20 A (рис.4). Когда мембрана деполяризована (т.е. положительно заряжен ее внутренний слой), “лопасти” поворачиваются вверх, к внеклеточной жидкости, и канал открывается. Если же этот слой приобретает отрицательный заряд, “лопасти” отгибаются в сторону, сжимая вход в пору, и канал оказывается закрытым. Таким образом, сенсор с его “лопастями” работает по весьма необычному принципу, основанному на присоединении гидрофобных катионов к рычагам, которые дают возможность мембранному электрическому полю выполнять механическую работу - открывать и закрывать проводящую ионы пору.
Рис. 4. Схема движения “лопастей” калиевого канала и их положение внутри мембраны, когда его ворота закрыты и открыты, и изменение структуры канала.
Обобщающая публикация по структуре белка KvAP и молекулярному механизму его работы была представлена в журнале “Nature” за пять месяцев до присуждения Нобелевской премии [3,4]. Мак-Киннон, начавший “канальную” карьеру в 30 лет, за истекшие годы преуспел в расшифровке и других молекулярных машин. Он занимается изучением еще нескольких каналов: калиевых, регулируемых ионами кальция; чувствительных к механическому воздействию, и тех, что избирательно пропускают ионы хлора. Проводятся также рентгено- и электронокристаллографические исследования, чтобы получить модель ацетилхолинового рецептора с более высоким, чем прежде, разрешением. Работа по выяснению механизмов действия отдельных молекул продолжается.
Питер Эгр (Peter Agre) родился в 1949 г. в Нордфилде (шт. Миннесота). В 1970 г. окончил колледж при Миннесотском университете в Миннеаполисе, где специализировался по химии. В 1974 г. получил степень доктора медицины в медицинской школе при Университете Джона Хопкинса в Балтиморе (шт. Мэриленд), с 1993 г. занимает там должность профессора биологической химии и профессора медицины.
Почти из 50 видов каналов, обнаруженных в мембране к середине 80-х годов, не было известно ни одного проводящего воду. Между тем клеточная мембрана, лишь ограниченно проницаемая для молекул воды, пропускает ее в цитоплазму эритроцитов, почечных проксимальных канальцев и некоторых других тканей с чрезвычайно высокой скоростью. Этот феномен можно было бы объяснить наличием специальных пор. Их многие искали, но безуспешно. Эгру посчастливилось первому. В 1988 г. вместе с коллегами он выделил (из эритроцитов и почечных проксимальных канальцев) и частично охарактеризовал неуловимый, встроенный в мембрану белок неизвестной функции. Как позже выяснилось, четыре его молекулы и образуют пору, по которой проникает вода.
Через три года П.Эгр и Дж.Престон получили кодирующую этот белок ДНК, чтобы в последующем “наработать” его, экспрессируя ген в ооцитах шпорцевой лягушки. Белок-канал, названный аквапорином-1 (AQP1), как теперь известно, входит в состав обширного семейства: подобные ему участвуют во множестве физиологических процессов всех живых клеток – и растительных, и животных.
Установив структуру аквапорина-1 рентгенокристаллографическим методом, Эгр определил длину и положение всех спиральных фрагментов и соединяющих их петель, угол, под которым соседние спирали отклоняются друг от друга; нашел места, где участки полипептидной цепи пересекают мембрану; выяснил роль консервативных в белках аквапоринового семейства аминокислотных остатков и влияние их отдельных боковых групп на стабильность и работу канала. В результате теперь мы в деталях знаем, как выглядит канал, пропускающий воду.
Рис. 5. Схема расположения фрагментов, составляющих мономер аквапорина.
Построен он из четырех молекул аквапорина-1 (каждая состоит из 269 аминокислотных остатков), которые образуют два повтора из трех a-спиральных участков (рис.5). Именно эти шесть спиралей и выстилают стенки проводящей поры и обусловливают ее гидрофобность. Небольшие же петли - цитоплазматическая (В) и внеклеточная (Е), - соединяющие повторы, обеспечивают строгую избирательность. N- и С-концевые фрагменты мономера закреплены во внутреннем слое мембраны и выходят в цитоплазму. В тетрамере каждая субъединица точно подогнана к двум соседним и связана с ними a-спиралями, которые выходят за пределы мембраны либо с внешней, либо с внутренней стороны. Функциональные петли В и Е расположены посередине между мембранными слоями, и в этом месте канал сужается (рис.6). Диаметр поры здесь составляет около 3 A, т.е. чуть больше диаметра молекулы воды (2.8 A). Ясно, что через столь малую щель не могут проникнуть крупные молекулы каких-либо растворимых веществ. Но через нее не проходят и протоны. Почему? Эгр это выяснил.
Рис. 6. Стереомодель субъединицы аквапорина и структура тетрамера, показанные с внеклеточной стороны и сбоку (вверху). Спирали в полном белке изображены в виде цилиндров.
В полипептидной цепочке каждой функциональной петли содержится фрагмент из следующих друг за другом аспарагина, пролина и аланина (Асн-Про-Ала). Положение петель в поре стабилизировано образованием ионных пар и водородных связей с определенными аминокислотными остатками в структурных спиралях. За счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий между пролинами 77 и 193 петли В и Е удерживаются в тесном соседстве. Гидрофобность внутренней поверхности поры и узость щели оказались очень важными для обеспечения исключительно высокой скорости проведения воды. Архитектура канала такова (узкая щель в центре и расширения на противоположных концах), что вода может проникать только в виде тонкой цепочки молекул, соединенных водородными связями. Было известно, что в грамицидиновом канале такая цепочка с большой эффективностью захватывает протоны. Но так как через аквапориновую пору они не просачиваются, это должен обеспечивать специальный механизм. Долгое время он оставался неизвестным в структурной биологии аквапорина. Считалось, что блокировка требует разрыва водородных связей в водной цепочке и образования новых, но уже с какими-то структурными элементами на поверхности поры. Эгр выяснил, что такой разрыв действительно включен в этот процесс и главная роль в нем принадлежит функциональным спиралям НВ и НЕ.
Поскольку дипольные моменты спиралей генерируют положительное электростатическое поле, атомы кислорода в молекуле воды, подошедшей в виде цепочки к центру мембранного пространства, ориентируются к участку Асн-Про-Ала (рис.7). В результате между кислородом и амидной (NH-) группой аспарагина образуется водородная связь, а в цепочке - разрыв. Так возникает препятствие на пути протона.
Рис. 7. Механизм, предотвращающий проведение протонов через водную пору. Благодаря диполям спиралей атомы кислорода в молекулах воды, оказавшихся в сужении поры, ориентируются к боковым группам аспарагинов 76 и 192 (вверху). После этого между их амидными группами и кислородом образуются водородные связи, а те, что соединяли непрерывную цепочку молекул воды, в этом месте обрываются.
Открытые Эгром аквапорины - биохимический фундамент для очень важной области физиологии и медицины. Подобные белки, способные проводить 3•109 молекул воды в секунду в расчете на каждый мономер, есть во всех без исключения живых клетках. У арабидопсиса содержится не меньше 35 вариантов этих белков, а у человека - 11, причем многие могут быть связаны с разными заболеваниями. Физиологическая роль аквапоринов особенно бросается в глаза в почках, через которые в сутки проходит от 150 до 200 л воды.
Мембранные каналы лежат в основе клеточных функций, таких как межнейронная сигнализация, мускульное сокращение, поглощение воды почками, всасывание корнями растений, поддержание осмотического давления у микроорганизмов. Нобелевские лауреаты - Р. Мак-Киннон и П. Эгр - не только установили структуры канальных белков, но и показали изящные молекулярные машины в действии.
На предприятии ОАО «НИИ «Гермес» (г. Златоуст) Федерального космического агентства проводятся работы по созданию технологии и оборудования для получения метастабильных структурированных биологически активных водных растворов с целью использования их в здравоохранении (физиотерапии). Структурирование водных растворов (воды) производится гидроударно-кавитационным методом, являющимся аналогом природных явлений, связанных с механическим воздействием на воду (водопады, водовороты, торнадо и др.). Анализ литературных междисциплинарных источников и результатов, проведенных исследований, дают основания утверждать, что активация воды происходит за счет изменения ее структуры. В воде частично разрываются водородные связи между молекулами в ассоциатах, представляющих объединения, состоящие из десятка и сотен молекул, связанных между собой водородными связями. Можно предположить, что в процессе кавитации приобретаемая отдельными молекулами поверхностная энергия, превышает энергию водородных связей. Это дает возможность существовать в воде определенное время не связанных между собой молекул. По имеющейся информации воздействия на воду различными физическими методами, ведущими к изменению ее структуры на наноуровне, относятся к нанотехнологии. На предприятии разработан ряд структуризаторов в которых вода под действием гидроударов и кавитации на наноуровне изменяет свою структуру.
Исследования методом сравнения показали, что наноструктурированная вода:
- соответствует требованиям Сан ПиН 2.1.4.559-96 на питьевую воду;
- имеет мягкий вкус, содержит в три раза меньше остаточного хлора (при обработки водопроводной воды);
- обладает повышенной на 10-15% электропроводностью и рН, растворяет накипь;
- отрицательно воздействует на ряд микробов и грибов;
- благоприятно воздействует на растения, животных и человека.
Исследованиями, проведенными в течение ряда лет на нескольких сотнях добровольцев и в лечебных учреждениях, установлено, что наноструктурированная вода:
- оказывает лечебное воздействие на заболевания, находящиеся в стадии ремиссии;
- нормализует работу желудка, кишечника, печени, почек и других органов и систем, обладает мочегонным действием;
- эффективно устраняет симптомы гриппа и ОРВИ в начальном периоде;
- способствует ускоренному заживлению ран, ожогов, снятию болей при ушибах, .травмах и заболеваниях суставов;
- смягчает и омолаживает кожу лица, увеличивает ее влагосодержание;
- улучшает зрение, устраняет синдром «сухого глаза» у постоянно работающих с компьютером;
- уменьшает усталость, повышает энергию и работоспособность;
- способствует быстрому восстановлению сил и поднятию настроения у больных.
Вода принимается в виде питья и наружно (компрессы, полоскание). Возрастных и временных ограничений при её приёме нет. Рекомендуется употреблять не менее 1-1,5 литра воды в сутки более трех раз в день по 200-250 грамм воды за 0,5 часа перед едой. Приготовленная вода должна употребляться в течение трех дней, т.к. лечебные свойства ее со временем падают. При кипячении свойства ее сохраняются. Приготовленные различные блюда и напитки с использованием наноструктурированной воды более вкусные и питательные. Добавление около 20% обработанной воды в любые напитки улучшает их вкус. Компрессы с использованием наноструктурированной воды эффективно проявляют себя при различных заболеваниях суставов, мышц, кожи и снятия усталости.
Наноструктурированная вода имеет ряд особенностей:
1. По своей структуре она сравнима со структурой воды бурных горных рек, водопадов, мощных водоворотов.
2. По лечебным свойствам ее можно отнести к гомеопатическим средствам, при приготовлении которых происходит многочисленные встряхивания жидких гомеопатических растворов (принцип «динамизации»).
З. В отличие от химических лекарственных средств она действует одновременно на все органы и системы человека, но в первую очередь на больные, лечение которых происходит по гомеопатическому принципу - «лечение через обострение». Это может в 5—10% случаев проявляться кратковременным дискомфортом в желудке, обострением хронических заболеваний суставов, печени и других органов;
4. Эффект лечения проявляется при ряде заболеваний в 60-80% случаев при употреблении 15-20 литров воды в течение 2-3 недель.
Разработан и запущен в производство малогабаритный аппарат «Структуризатор Уварова», имеющий следующие характеристики: производительность 5 л/час, мощность 0,36 кВт, напряжение 220 В, масса 12 кг, габариты 140х280х380мм. На структуризатор получен «Сертификат соответствия» системы «Биостандарт» № 1Ш.0001. 04Ю1Ц00И.Л004. Срок действия до 2014 г. Разработка признана актуальной и перспективной ведущими НИИ Минздравсоцразвития РФ и РАМН, многие из них проявили заинтересованность в проведении совместных работ. Получено Свидетельство № 20257 на полезную модель «Активатор». Результаты исследований изложены в шести публикациях и удостоены дипломами ряда российских и региональных выставок.
Рис. 8. Малогабаритный «Структуризатор Уварова»